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桂花中的主要生物活性化合物和阿克苷（Acteoside）通過調節腸道微生物群緩解小鼠實驗性結腸炎
2022-02-18
關鍵詞：AKK菌
近幾十年來，全球炎癥性腸病（IBD）的發病率持續增高，IBD已逐漸成為我國消化科的常見病。
IBD病情發展緩慢且反復發作，其主要特征是腹部疼痛、腹瀉、有粘液和膿血便，同時也會累及皮膚、口腔和眼睛以及骨骼肌肉系統等，甚至增加大腸發送癌變風險。目前病因未明，與環境、遺傳及腸道微生態等多因素相互作用導致腸道異常免疫失衡有關。
研究背景
炎癥性腸病（IBD）主要包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病，在全世界范圍內患病率很高。免疫反應失調導致腸道上皮屏障的失調，這有助于結腸炎癥的發展和進一步導致IBD。因此，抑制炎癥的藥物可用于治療IBD。然而，傳統藥物（包括5-氨基水楊酸鹽和柳氮磺胺吡啶（SASP））的使用受到其嚴重副作用的限制，例如腹痛和低臨床療效與較長的給藥時間。腸道微生物群可能是治療IBD的重要靶點，超過1014個共生細菌共存于宿主的腸腔和粘膜中，影響代謝功能和免疫系統。腸道微生物群的生態失調與IBD的發作有關，在IBD患者中，腸道微生物群的多樣性減少，伴隨著潛在促炎細菌（包括腸桿菌科和梭桿菌科）的富集，以及潛在抗炎細菌（例如厚壁菌門）的減少。先前的研究表明，生態失調的腸道微生物群的轉移誘導了無菌小鼠的腸道炎癥，這表明腸道生態失調可導致小鼠IBD。糞便微生物群移植（FMT）可用于治療IBD患者。目前的人體研究表明，使用FMT對IBD有效。此外，FMT還可用于研究飲食或藥物劑量的微生物群對疾病的保護作用，一項FMT研究表明，綠色或普洱茶可以改善由腸道微生物群介導的小鼠結腸炎。桂花是一種常見的食用和藥用花卉，在傳統中醫中被用于治療胃痛和便血。已發現桂花中的主要生物活性物質是苯丙素苷類成分，特別是阿克苷（acteoside，也稱為毛蕊花苷）。阿克苷具有多種生物活性作用，如抗氧化、神經保護和抗炎作用，其抗炎活性已在幾種細胞系（例如，RAW 264.7 巨噬細胞、IEC-6 細胞和 BV-2 小膠質細胞）或動物研究（例如，肺損傷小鼠和腦受損大鼠）中有報道。然而，阿克苷對結腸炎的影響尚不清楚。先前的一項研究發現，桂花可減弱化學誘導的結腸炎小鼠的疾病活性指數評分、結腸組織的組織學損傷和促炎酶活性。然而，在桂花對結腸炎的保護作用中腸道微生物群的作用及其分子機制尚未得到研究。該研究探討了桂花提取物（OFE）和阿克苷對DSS誘導結腸炎的治療效果和分子機制，通多組學研究了OFE和阿克苷對DSS誘導的腸道微生物組和代謝組功能障礙的影響。具體而言，用FMT方法研究了腸道微生物群在保護作用中的角色。
研究內容
桂花提取物（OFE）的制備：從浙江省臨安市采集新鮮的桂花，室溫下運至實驗室后在40 °C下真空干燥。粉碎的桂花（40目）使用80%丙酮以1：25（g / mL）的材料/溶劑比例提取，這些勻漿在真空下被過濾后用旋轉蒸發器在真空下干燥。收集獲得的OFE并將其保存在-80°C直至進一步使用。 使用蒽酮-硫酸法（以葡萄糖為標準）測定OFE中總糖的含量。使用考馬斯亮藍法測量OFE中總蛋白質的含量。采用高效液相色譜（HPLC）分析OFE中苯丙素苷類成分的組成，包括阿克苷、紅景天苷和松果菊苷。
實驗性結腸炎和治療實驗：SPF雌性C57BL / 6小鼠（20±2g，8周齡）在標準條件下飼養適應7天后，將48只小鼠隨機分為8組，包括健康組、DSS組、DSS+低劑量OFE（LOFE）組、DSS+高劑量OFE（HOFE）組、DSS+低劑量阿克苷（LA）組、DSS+高劑量阿克苷（HA）組、DSS+表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）組、DSS+柳氮磺胺吡啶（SASP）組。健康組的小鼠接受蒸餾飲用水8天，其他組小鼠均接受含3% DSS的飲用水8天以建立結腸炎模型。來自DSS + LOFE組、DSS + HOFE組、DSS + LA組和DSS + HA組的小鼠分別通過強飼法每日接受350 mg/kg體重（BW）OFE，700 mg/kg BW OFE，100 mg/kg BW阿克苷和200 mg/kg BW阿克苷。使用體表面積歸一化方法計算OFE和阿克苷的人類當量劑量（HED）。天然產物（EGCG）和臨床藥物（SASP）作為陽性對照，通過強飼法以200mg/kg BW的劑量給予小鼠。每天測定小鼠的體重。實驗結束時將小鼠禁食4小時后使用血清熒光素異硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖濃度來表征腸道通透性。5小時后，麻醉小鼠并處死以收集血液、結腸組織和糞便樣本。部分血清樣品用于測定525nm處的熒光強度，其他血清樣品用于分析細胞因子（腫瘤壞死因子α（TNF-α），白細胞介素（IL）-8，IL-6和IL-10）的水平。收集糞便樣品進行微生物組和代謝組學譜分析。收集并測量結腸組織長度，然后輕輕洗滌部分結腸組織用于蘇木精-伊紅（H&E）染色、阿利新藍-過碘酸-雪夫（AB-PAS）染色和免疫組織化學（IHC）分析。此外，其他結腸組織用于分析酶活性（超氧化物歧化酶（SOD）和髓過氧化物酶（MPO））和丙二醛（MDA）水平。
糞便微生物群移植實驗。供體小鼠：將18只小鼠隨機分為3組，包括正常組、HOFE組和HA組。三組小鼠分別通過口服強飼法接受蒸餾水、OFE和阿克苷8天。OFE和阿克苷分別以700和200 mg/kg BW的劑量給予。在第8天，收集新鮮糞便以分析微生物組特征，還收集新鮮的糞便以準備每天的FMT材料。受體小鼠：將30只小鼠隨機分為健康（FMT）組、DSS（FMT）組、正常+DSS（FMT）組、HOFE+DSS（FMT）組、HA+DSS（FMT）組和HA+DSS（FMT）組5組。健康（FMT）組的小鼠接受蒸餾飲用水8天，其他組小鼠均接受含3% DSS 的飲用水8天。將正常+DSS（FMT）組、HOFE+DSS（FMT）組和HA+DSS（FMT）組的小鼠分別口服供體小鼠正常組、HOFE組和HA組的糞便微生物懸浮液，其他組小鼠口服蒸餾水，通過口服強飼將懸浮液移植到受體小鼠，持續8天。每天測定小鼠的BW，在第8天使用FITC-葡聚糖測定腸道通透性，然后麻醉并處死小鼠以收集血液、結腸組織和糞便樣本，進行H&E染色、AB-PAS染色、IHC染色、細胞因子譜和酶活性分析。
研究結果
OFE的植物化學組成。總糖和總蛋白含量分別為45.6±1.24/100 g和1.93±0.08/100 g。OFE含有29.8±0.97%的阿克苷，3.12±0.03%的紅景天苷和0.62±0.01%的松果菊苷。
OFE或阿克苷治療可預防DSS誘導的小鼠結腸炎。OFE或阿克苷治療恢復了結腸炎引起的體重減輕、結腸長度縮短、炎癥和氧化應激。使用含3% DSS的飲用水8天誘導實驗性結腸炎，結腸炎小鼠表現出顯著的體重減輕和結腸長度縮短，而這些影響能通過在結腸炎小鼠中施用OFE、阿克苷和陽性對照藥物來恢復。DSS處理導致TNF-α、IL-8和IL-6水平的顯著增加以及IL-10水平的降低，其也可被OFE或阿克苷以劑量依賴性方式顯著逆轉（IL-6除外）。DSS組的MDA和MPO活性顯著增加，SOD活性顯著降低，OFE或阿克苷以劑量依賴性方式恢復了這些影響。值得注意的是，SASP和EGCG顯著降低了DSS誘導的小鼠體重減輕、結腸長度縮短、炎癥和氧化應激，證明實驗性結腸炎模型的建立。
圖上 OFE或阿克苷治療改善小鼠結腸炎
圖下 結腸組織的組織學分析
OFE或阿克苷治療恢復了結腸炎相關的腸道損傷。H&E染色、AB-PAS染色和IHC染色分析小鼠結腸組織的組織學損傷發現，與健康組的結腸組織相比，DSS組的結腸組織顯示出炎癥細胞浸潤、隱窩膿腫和粘膜結構損傷。根據結腸組織中的組織損傷和炎性細胞浸潤評估炎癥相關的組織學評分，OFE或阿克苷的施用顯著降低了結腸炎小鼠的評分，HOFE和SASP組表現出對結腸損傷的最佳保護作用。此外，DSS + LOFE，DSS + HOFE，DSS + HA和DSS + EGCG組的評分沒有顯著差異。AB-PAS染色顯示DSS處理導致結腸組織中杯狀細胞的消耗，重要的是，所有組（DSS和DSS + LOFE組除外）中的AB-PAS陽性杯狀細胞沒有顯著差異。使用IHC染色觀察結腸中閉鎖小帶蛋白1（ZO-1）和黏蛋白2（MUC2）的表達，并根據陽性區域的綜合光密度進行評估，結果發現，DSS組結腸中的ZO-1和MUC2相對表達分別比健康組低0.60倍和0.40倍，值得注意的是，所有組（DSS組除外）ZO-1和MUC2的相對表達均無顯著差異。FITC-葡聚糖測定腸道通透性顯示，與健康組小鼠相比，DSS組小鼠血清中FITC-葡聚糖的濃度幾乎高出0.39倍。此外，OFE或HA處理顯著降低了FITC-葡聚糖濃度。總的來說，OFE或阿克苷改善了DSS誘導的腸道損傷，但不是以劑量依賴性的方式。
圖上 結腸組織切片的分析
圖下 NF-κB p65、p-IκBα和IκBα在不同組結腸組織中的相對表達量
OFE或阿克苷治療降低了結腸炎小鼠中NF-κB途徑的激活。為揭示OFE或阿克苷的潛在抗結腸炎分子途徑，使用蛋白質印跡法測量NF-κB途徑的相對表達。在各種刺激下，IκBα可以被磷酸化和降解，導致NF-κB從細胞質基質易位到細胞核，然后NF-κB與DNA結合并導致細胞因子和趨化因子的轉錄，從而進一步激活免疫應答。蛋白質印跡結果顯示，DSS處理增加了NF-κB p65的核水平，但通過高劑量OFE或阿克苷治療恢復了NF-κB p65的核水平。結腸炎小鼠中胞質p-IκBα和IκBα的比值顯著高于健康小鼠，但通過OFE或阿克苷治療結腸炎小鼠中細胞質p-IκBα和IκBα的比值顯著降低。總的來說，OFE或阿克苷可能部分滅活NF-κB途徑，以防止DSS誘導的結腸炎。
OFE或阿克苷治療恢復了結腸炎小鼠腸道微生物群和代謝組的失調。使用16s rRNA測序分析小鼠腸道微生物群譜發現，所有四組的糞便樣本中共鑒定出671個OTUs，其中355個OTUs由這些組共享。Simpson和Chao指數分別顯著上升和下降，然而，這些并沒有通過HOFE或HA處理恢復，這意味著HOFE或HA不能防止DSS誘導的糞便微生物群豐富度和多樣性降低。在主成分分析（PCA）圖中觀察到DSS組與其他組之間的顯著分離，分層聚類樹也證明這一點。然而，DSS + HOFE或DSS + HA組比DSS組更接近健康組，表明HOFE或HA治療至少部分逆轉了結腸炎誘導的腸道微生物群生態失調。在門水平上，厚壁菌門和擬桿菌門占糞便微生物群的大部分（大于80%）。DSS處理分別顯著降低Odoribacter和增加脫硫弧菌屬的相對豐度。然而，HOFE或HA治療顯著逆轉了這些趨勢。在種水平上，在HOFE或HA組中觀察到DSS誘導的多形擬桿菌減少的增加，但健康組和DSS組之間沒有統計學意義。HOFE或HA處理也顯著抑制了DSS誘導的Akkermansia muciniphila的減少。總的來說，HOFE或HA治療恢復了結腸炎誘導的糞便微生物群相關生態失調。
圖上 糞便樣本的微生物組學分析
圖下 與DSS組相比，Health、DSS + HOFE、DSS + HA 組中參與改變通路的潛在生物標志物
使用UPLCQTOF-MS / MS分析糞便樣品的代謝組發現，在這些樣品中，鑒定出653種用于正離子模式的代謝物和362種用于負離子模式的代謝物。PCA圖中觀察到DSS組和健康組之間的分離，而DSS + HA和DSS + HOFE組存在于DSS和健康組之間。進行OPLS-DA建模以評估數據質量和鑒定潛在的生物標志物，DSS處理共更換代謝物109例，其中HOFE和HA分別還原20種和30種。這表明HOFE或HA治療至少部分地恢復了DSS誘導的結腸炎小鼠腸道代謝組的改變。
對顯著變化的代謝物進行京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路分析。從代謝通路來看，DSS處理有6個信號通路富集（鞘脂代謝、鞘脂信號通路、礦物質吸收、初級膽汁酸生物合成、癌癥的中心碳代謝和ABC轉運蛋白），HOFE或HA處理抑制了其中2個（礦物質吸收和癌癥的中心樞碳代謝）。HOFE和HA下調了相同的代謝通路，包括蛋白質消化和吸收、細胞凋亡、壞死性凋亡、氨酰-tRNA生物合成、苯丙氨酸代謝、癌癥的中心碳代謝、氨基酸的生物合成以及礦物質吸收。此外，HA抑制了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路以及精氨酸和脯氨酸代謝通路，而HOFE抑制了肌動蛋白細胞骨架通路、黑色素生成通路、leishmaniasis pathway、GnRH信號通路、amebiasis pathway和serotonergic synapse pathway的調節。
OFE或阿克苷通過調節腸道微生物群來改善DSS誘導的小鼠結腸炎。OFE或阿克苷能調節供體小鼠的腸道微生物群。使用來自供體小鼠的糞便樣品制備FMT材料，因此，必須鑒定HOFE或HA組中的特征細菌。16s rRNA測序結果表明，HOFE或HA處理改變了幾種細菌的相對豐度。在屬水平上，HA組中Akkermansia、Parabacteroides和Bacteroides屬的相對豐度富集，但HOFE僅提高了Akkermansia屬的相對豐度。具體而言，A. muciniphila、Parabacteroides goldsteinii和B. thetaiotaomicron的改變顯示出與屬水平相似的趨勢。總的來說，這些表明HOFE或HA治療顯著豐富了益生菌。
圖左 糞便微生物群移植治療可改善葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的急性結腸炎
圖右 糞便微生物群移植治療小鼠的結腸組織的組織學分析和切片分析
來自OFE或阿克苷給藥小鼠的糞便微生物群恢復了體重減輕、結腸長度縮短、炎癥和氧化應激。將來自供體小鼠的糞便微生物懸浮液移植到相應的受體小鼠中，旨在鑒定腸道微生物群在OFE或HA治療結腸炎中的作用。與DSS（FMT）組和正常+ DSS（FMT）組的小鼠相比，接受HOFE或HA的糞便微生物群移植的小鼠顯示出較低的體重減輕。同樣，FMT治療顯著減少了DSS誘導的結腸長度縮短；結腸炎小鼠的IL-8水平增加，但FMT處理后降低。重要的是，DSS誘導的促炎細胞因子（TNF-α和IL-6）的過表達和抗炎細胞因子（IL-10）的過表達通過FMT治療部分恢復。值得注意的是，移植HOFE或HA小鼠的糞便微生物群顯示出比正常飲食小鼠的更強的調節作用。FMT處理顯著逆轉了結腸炎小鼠MDA和MPO活性的增加以及SOD活性的降低。然而，在移植正常飲食、HOFE和HA的微生物群中，除了HOFE + DSS（FMT）組的MPO水平顯著低于正常+ DSS（FMT）組的MPO水平外，其他都沒有顯著性。總的來說，這些結果表明，FMT治療顯著抑制了結腸炎相關的體重減輕、炎癥和氧化應激。具體而言，移植HOFE或HA小鼠的糞便微生物群在結腸炎小鼠中表現出比正常飲食小鼠更強的保護作用，以防止體重減輕，結腸長度縮短和炎癥。移植OFE或阿克苷給藥小鼠的糞便微生物群恢復了結腸炎相關的組織學損傷。H&E染色和AB-PAS染色顯示，FMT治療部分保護免受DSS誘導的炎癥細胞浸潤、上皮結構損傷和結腸組織中杯狀細胞的消耗。FMT處理的小鼠顯示出比結腸炎小鼠更低的炎癥相關組織學評分，并且FMT處理的大腸桿菌小鼠的杯狀細胞水平恢復到健康小鼠的水平。從IHC染色結果來看，HOFE+DSS組中ZO-1和MUC2的相對表達分別比DSS（FMT）組高1.46倍和2.39倍。同樣，HA+DSS組中ZO-1和MUC2的相對表達分別比DSS（FMT）組高1.34倍和2.47倍。盡管HOFE+DSS或HA + DSS組中ZO-1的相對水平高于正常+ DSS組，但這些組之間沒有顯著差異。值得一提的是，與正常+DSS組相比，HOFE+DSS或HA+DSS組在結腸組織中表現出更高水平的MUC2。此外，HOFE + DSS（FMT）或HA + DSS（FMT）組的血清FITC?葡聚糖濃度高于正常+ DSS（FMT）組。這些發現表明，來自HOFE或HA小鼠的FMT比來自正常飲食小鼠的FMT對結腸組織損傷具有更大的保護作用。
圖 FMT處理小鼠糞便樣本的微生物組分析
FMT治療調節了大腸小鼠的腸道微生物群。研究FMT處理小鼠的腸道微生物組譜發現，Simpson指數表明，HOFE + DSS（FMT）或HA + DSS（FMT）組中的腸道微生物組比DSS組更多樣化、更豐富，而HOFE + DSS（FMT）組或HA + DSS（FMT）組中腸道微生物組的豐富度相對于正常+ DSS（FMT）組更高。這些結果表明，與正常飲食小鼠的FMT相比，來自HOFE或HA小鼠的FMT增加了結腸炎小鼠腸道微生物群的豐富性。在分層聚類樹和PCA圖中，DSS組與其他組之間存在差異。然而，健康組、正常+DSS（FMT）、HOFE+DSS（FMT）和HA+DSS（FMT）組之間無顯著差異。FMT處理在屬水平上顯著提高了結腸炎小鼠中Akkermansia和Bacteroides的相對豐度。相應地，FMT治療顯著提高了A. muciniphila和B. thetaiotaomicron的相對豐度。盡管正常+DSS（FMT）組與其他兩個FMT治療組之間沒有統計學意義，但HOFE + DSS（FMT）組或HA + DSS（FMT）組的A. muciniphila的相對豐度高于正常+ DSS（FMT）組。總的來說，這些結果表明，FMT治療恢復了DSS誘導的結腸炎小鼠的腸道微生物群生態失調。
討 論
粘液層存在于上皮細胞的頂部，以防止腸道中的病原體和細菌來源的物質，MUC2是杯狀細胞釋放到腸腔中的主要粘蛋白。此外，上皮細胞通過緊密連接蛋白（如ZO-1）緊密連接，這進一步阻止了病原體及其代謝物的侵襲，粘蛋白和緊密連接蛋白有助于腸上皮完整性。然而，DSS的毒性誘導氧化應激，結腸組織的炎癥和進一步的組織損傷。然后，受損的腸道屏障功能引起病原體和細菌衍生劑的易位，這促進了結腸的氧化應激和炎癥。在該研究中，OFE或阿克苷通過應用的劑量改善了DSS誘導的結腸炎癥，氧化應激和結腸在大腸小鼠中的結腸通透性。重要的是，含有相同量的阿克苷和OFE對DSS誘導的結腸炎表現出相似的保護作用，這表明OFE的反溶血作用可能主要由阿克苷引起。
NF-κB通路是參與結腸炎發展的重要分子機制。刺激時NF-κB的活化導致IκBα的磷酸化和NF-κB易位到細胞核中，從而促進促炎細胞因子的分泌。該研究表明OFE或阿克苷部分抑制NF-κB途徑的激活，這可能有助于其抗結腸炎。
結腸炎的發生伴隨著腸道微生物群多樣性和豐富性的減少。在該研究中，盡管觀察到DSS誘導的小鼠結腸炎中HOFE或HA并沒有逆轉這些趨勢。然而，由DSS誘導的腸道微生物群的改變由HOFE或HA部分地恢復。具體而言，Odoribacter是一種產生丁酸鹽的細菌，有助于調節先天免疫信號傳導，以防止結腸炎。脫硫弧菌被認為是一種產生細胞毒性硫化氫的有害細菌，被發現在IBD患者中富集，可能與IBD的發病機制有關。在結腸炎小鼠中，施用A. muciniphila可以保護腸道屏障并減少炎癥。此外，通過激活芳烴受體和改變免疫細胞穩態，多形擬桿菌可以減少結腸炎小鼠的腸道炎癥。在該研究中，HOFE或HA降低了結腸炎小鼠中脫硫弧菌的相對豐度并增加了Odoribacter、A. muciniphila和多形擬桿菌的相對豐度，表明 OFE 或 阿克苷可以通過調節腸道微生物群來改善DSS誘導的結腸炎。為了證實這一假設，后來進行了一項FMT研究。
鞘氨醇半乳糖苷、植物鞘氨醇、鞘氨酸和鞘氨醇是鞘脂代謝和鞘脂信號通路中的生物標志物，這些標志物地增加反映了DSS誘導的結腸炎小鼠中這兩種通路的失調。鞘脂代謝在小兒IBD患者中上調，炎癥與糞便中鞘脂代謝物的組成之間存在聯系。糞便中鞘脂的增加可能表明腸細胞的細胞膜受損。在該研究中，HOFE或HA顯著降低了鞘氨醇的水平，表明HOFE或HA可以通過調節結腸鞘脂代謝來緩解腸道炎癥和結腸組織損傷。
花生四烯酸（AA）可以作為一種有效的促炎介質，因為據報道其代謝物有利于IBD期間的炎癥和組織損傷，AA能促進腸上皮細胞中趨化因子的產生，并加劇遺傳易感IBD小鼠的腸道炎癥。在該研究中，大腸桿菌小鼠的AA水平升高，而HOFE或HA處理降低AA水平。
在結腸炎小鼠中，HOFE或HA降低了氨基酸途徑的生物合成，DSS+HA組中苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸和色氨酸的水平相對較低，DSS+HOFE組中丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸和色氨酸的水平相對較低。在IBD患者和IL-10缺陷小鼠中也觀察到更高水平的丙氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。結腸炎小鼠糞便中苯丙氨酸和脯氨酸的較高水平可能部分是由大腸小鼠的炎癥和上皮損傷引起的吸收不良引起的。
在DSS+HOFE和DSS + HA組中色氨酸、吲哚乳酸（ILA）的微生物代謝產物富集。以前的研究報道，色氨酸可以通過 A. muciniphila 或多形擬桿菌代謝成ILA。 ILA作為AHR激活劑，能夠調節炎癥反應，減少腸道中的微生物易位，并修復受損的腸上皮。在該研究中， DSS+HOFE和DSS+HA組中富集的 A. muciniphila 或多形擬桿菌可能將色氨酸代謝為ILA， 其介導AHR激活誘導的炎癥穩態和上皮修復。
分析了阿克苷的代謝物發現在糞便樣本中沒有阿克苷。Chen等人通過強飼法給予Sprague-Dawley（SD）大鼠40mg / kg體重的阿克苷，發現在12和24 h測試時，阿克苷的累積排泄量分別僅為藥物量的0.003%和0.004%；此外，在接下來的12小時內，阿克苷的累積排泄沒有顯著變化。這意味著糞便中的阿克苷在前24小時內排泄，其在糞便中的水平相對較低。在該研究中，糞便樣本中阿克苷的含量可能太低而無法檢測到。以前的報道表明，阿克苷可以代謝成咖啡酸。咖啡酸可以通過結腸微生物群代謝成3-（3′羥基苯基）丙酸。在該研究中，3-（3′-羥基苯基）丙酸的水平在施用阿克苷和OFE的結腸炎小鼠中增強。然而，3-（3′-羥基苯基）丙酸在炎癥中的作用尚不清楚。此外，在該中沒有檢測到其他羥基肉桂酸，如咖啡酸和3，4-二羥基苯乙醇。這可以通過結腸炎小鼠中阿克苷代謝模式的改變來解釋。Felgines等人將檸檬馬鞭草浸液（主要是阿克苷）隨意滴注給DSS誘導的結腸炎小鼠14天，在尿液中注意到羥基肉桂酸的排泄，特別是咖啡酸。隨后在接下來的7天內補充了4% DSS的輸注，觀察到咖啡酸和總羥基肉桂酸的尿排泄增加，表明在結腸炎條件下尿液中阿克苷的代謝模式發生了變化。這意味著糞便中阿克苷的代謝模式在結腸炎小鼠中可能會改變。
因此，綜上所述，OFE或阿克苷可以恢復DSS誘導的腸道炎癥，氧化應激，結腸組織損傷，NF-κB途徑的激活以及結腸炎小鼠腸道微生物群和代謝組的紊亂。FMT用于研究HOFE或HA劑量小鼠的腸道微生物組是否可以改善小鼠結腸炎的癥狀。重要的是，來自正常飲食供體小鼠的腸道微生物組可以幫助重建和諧的腸道微生物組，然后防止小鼠結腸炎。因此，應比較來自正常飲食，HOFE飲食和HA飲食給藥小鼠的腸道微生物組對FMT改善小鼠結腸炎的影響，旨在確定來自HOFE或HA供體小鼠的腸道微生物組是否相對于大腸桿菌小鼠具有更好的保護作用來自正常飲食供體的小鼠。
HOFE或HA被給予供體小鼠以塑造它們的腸道微生物組。結果顯示，HOFE或HA組中富集了Akkermansia和A. muciniphila。然而，Parabacteroides、P. goldsteinii、擬桿菌屬和多形擬桿菌的相對豐度僅在HA組中富集。這些結果表明，OFE或阿克苷可能是增加潛在有益細菌的益生元，這意味著OFE或阿克苷可以通過增加有益細菌來改善小鼠結腸炎。通過強飼將來自供體小鼠的糞便細菌懸浮液移植到受體小鼠，與正常飲食供體小鼠的細菌懸浮液相比，來自HOFE或HA供體小鼠的細菌懸浮液對DSS誘導的炎癥，氧化應激，結腸組織學損傷和腸道通透性表現出更好的保護作用。也就是說，OFE或阿克苷通過調節腸道菌群來改善DSS誘導的小鼠結腸炎。HOFE+DSS（FMT）或HA+DSS（FMT）組腸道微生物組的豐富性和多樣性大于正常+ DSS（FMT）組和DSS（FMT）組。Akkermansia、A. muciniphila、擬桿菌屬和多形擬桿菌的相對豐度在HOFE+DSS（FMT）或HA+DSS（FMT）組中富集。A. muciniphila的相對豐度在DSS+HA、HA和HA+DSS（FMT）組中富集，這意味著A. muciniphila可能在阿克苷對結腸炎的治療效果中起重要作用。分析OFE或阿克苷處理的結腸炎小鼠和FMT治療的結腸炎小鼠組地微生物群與生化指標的相關性。在OFE或阿克苷處理的結腸炎小鼠和FMT處理的結腸炎小鼠中，A. muciniphila和多形擬桿菌的相對豐度與結腸長度、IL-10、MUC2和杯狀細胞數量呈正相關，與TNF-α、IL-6、MPO活性、FITC-葡聚糖和炎癥相關的組織學評分呈負相關。這意味著這兩種細菌可能在OFE和阿克苷的抗結腸炎特性中起關鍵作用。
該結果表明，桂花及其主要生物活性阿克苷可防止DSS誘導的小鼠結腸炎，其特征在于抑制腸道炎癥，氧化應激，腸道通透性以及腸道微生物組和代謝組的功能障礙。NF-κB的失活參與OFE或阿克苷對DSS誘導的結腸炎的保護作用。HOFE或HA的施用富集了小鼠糞便中的益生菌（例如，A. muciniphila和多形擬桿菌），這表明OFE和阿克苷的潛在提高益生元特性。FMT研究發現，與從正常飲食的供體小鼠接受糞便細菌的結腸炎小鼠相比，從HOFE或HA給藥的供體小鼠接受糞便細菌的結腸炎小鼠的腸道炎癥和結腸組織損傷水平降低。在HOFE或HA處理的結腸炎小鼠、HOFE或HA給藥的供體小鼠以及接受HOFE或HA給藥供體小鼠糞便微生物群的結腸炎小鼠中A. muciniphila的相對豐度富集，這表明A. muciniphila可能至少部分介導了OFE或阿克苷的抗結腸炎作用。總的來說，這項研究表明，OFE或阿克苷通過調節腸道微生物群來改善DSS誘導的小鼠結腸炎。
總 結
將桂花（O. fragrans）提取物 (OFE) 和阿克苷（acteoside）施用于硫酸葡聚糖鈉（DSS）誘導的結腸炎小鼠，結果表明，OFE 或阿克苷可改善結腸炎小鼠的腸道炎癥、氧化應激和核因子-κB（NF-κB）的激活。OFE或阿克苷也部分恢復了結腸炎小鼠腸道微生物組的失調，其特征是腸道微生物組結構的改變和有益細菌（AKK菌和多形擬桿菌的富集）。DSS誘導的結腸炎小鼠腸道代謝組功能障礙（例如，鞘氨醇代謝和氨基酸代謝）也通過 OFE和阿克苷部分恢復。一項糞便微生物群（FMT）移植研究表明，與正常飲食供體小鼠的FMT相比，OFE或阿克苷給藥供體小鼠的FMT顯著抑制了結腸炎癥狀。
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